Egg allergens in wine. Validation of a new automated method for ovalbumin quantification

Abstract

Ovalbumin (ova), a natural clarifying protein, is particularly suitable for clarifying red wines. It helps improve the tannic and polyphenolic stability of the wine by removing the most astringent tannins and contributing to soften and refine the structure. Ova binds to suspended particles, proteins, polysaccharides, and, to a lesser extent, tannins through electrostatic and hydrophobic interactions, forming large complexes that can be removed from the wine through fining and/or filtration before bottling. However, allergies to ova are common and can cause symptoms ranging from mild, such as skin rashes, to severe, such as difficulty breathing and anaphylactic reactions in severe cases. Internationally, significant food safety measures have been implemented, such as regulation (EU) no 1169/2011 of the european union, as well as the food allergen labelling and consumer protection act (falcpa) by the fda and regulations of food standards australia new zealand (fsanz), among other national regulations. These regulations govern the declaration of allergenic substances on product labels and establish guidelines for the identification and labelling of ingredients, including protein clarifying agents. Specifically concerning wines, eu implementing regulation no 579/2012 requires special labelling for wines that have been treated with allergenic additives. Additionally, resolution OIV-secsan 709-2022 establishes criteria for the quantification of allergenic residues in wines, with a quantification limit of 500 µg/l for ova. Several analytical methods exist for determining the presence of ovalbumin in wine, the elisa method being the most commonly used for quantification. Alternatively, there are rapid immunochromatographic tests or mass spectrometry. These methods may present challenges in terms of cost, operational complexity, and/or automation. Biosystems introduces a new method for the automated quantification of ova in wine, based on an immunoturbidimetric assay on biosystems analysers. A reagent has been developed in which a specific polyclonal antibody to ova has been immobilized on the surface of polystyrene nanoparticles. Antibody-ova interactions form a meshwork that leads the agglutination process. The degree of agglutination causes an increase in turbidity that can be measured by spectrophotometry and is proportional to the amount of ova present in the sample and quantifiable through interpolation of these values on a calibration curve generated by known concentration calibrators. The method includes an extraction solution that facilitates the rapid extraction and stabilization of ovalbumin from wine in a single step, all at room temperature and in just 15 minutes, in a simple and efficient manner. Additionally, a concentrated ova solution (spike solution) is provided, allowing internal controls and recovery studies to be performed. The validation results obtained on the biosystems y15 analyser show that the method has a linear range of 50 to 1000 µg/l, with a correlation coefficient (r2) greater than 0.99. The limit of quantification (loq) is 50 µg/l, and the values of relative standard deviation (rsd%) under intermediate conditions across the entire measurement range between 3 and 10%. Recoveries obtained for different concentrations of purified ova fall within the range of 90-110% in all cases. Additionally, comparisons were made with commercially available elisa methods, obtaining good correlation between both methods. The biosystems ovalbumin method has been validated for wines and other beverages and is a useful tool for automated, rapid, accurate, and simple determination of ova.

Alérgenos de huevo en el vino. Validación de un nuevo método automatizado para la cuantificación de ovoalbúmina

La ovoalbúmina (ova), una proteína clarificante natural, es especialmente adecuada para la clarificación de vinos tintos. Ayuda a mejorar la estabilidad tánica y polifenólica del vino, eliminando los taninos más astringentes y contribuyendo a suavizar y refinar la estructura. La ova se une a las partículas en suspensión, proteínas, polisacáridos y, en menor medida, a los taninos a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, formando complejos grandes que pueden ser eliminados mecánicamente del vino mediante desfangado y/o filtración antes del embotellado.  Sin embargo, las alergias alimentarias a la ova son frecuentes y pueden provocar síntomas que van desde leves, como erupciones cutáneas, hasta graves, como dificultad para respirar y reacciones anafilácticas en casos severos. A nivel internacional, se han implementado medidas significativas en seguridad alimentaria, como el reglamento (UE) nº 1169/2011de la unión europea, así como la food allergen labeling and consumer protection act (falcpa) de la fda y las regulaciones de food standards australia new zealand (fsanz), entre otras regulaciones nacionales. Estas normativas regulan la declaración de sustancias alergénicas en la etiqueta de los productos y establecen pautas para la identificación y etiquetado de ingredientes, incluyendo agentes clarificantes proteicos. Específicamente en el caso de los vinos, el reglamento de ejecución de la UE nº 579/2012 obliga al etiquetado especial para aquellos vinos que hayan sido tratados con aditivos alergénicos. Además, la resolución oiv-secsan 709-2022 establece criterios para la cuantificación de residuos alergénicos en vinos, con un límite de cuantificación de 500 µg/l para la ova. Existen varios métodos de análisis para determinar la presencia de ovoalbúmina en el vino, siendo el método elisa el más utilizado para la cuantificación. Alternativamente, existen pruebas rápidas inmunocromatográficas o espectrometría de masas. Estos métodos pueden presentar desafíos en cuanto a costo, complejidad operativa y/o automatización. Biosystems presenta un nuevo método para la cuantificación automatizada de la ova en vino, basado en un ensayo inmunoturbidimétrico en analizadores de biosystems. Se ha desarrollado un reactivo en el que un anticuerpo policlonal específico de la ova se ha inmovilizado en la superficie de nanopartículas de poliestireno. Las interacciones anticuerpo-ova forman una malla que dirige el proceso de aglutinación. El grado de aglutinación provoca un incremento de la turbidez que puede ser medida por espectrofotometría y es proporcional a la cantidad de ova presente en la muestra y cuantificable a través de la interpolación de estos valores en una curva de calibración generada por los calibradores de concentración conocida. El método incluye una solución de extracción que facilita la rápida extracción y estabilización de la ovoalbúmina del vino en un solo paso, todo ello a temperatura ambiente y en tan solo 15 minutos, de manera simple y eficiente. Además, una solución concentrada de ova que permite realizar controles internos y estudios de recuperación.  Los resultados de la validación realizada en el analizador y15 de biosystems muestran que el método tiene un rango lineal de 50 a 1000 µg/l, con un coeficiente de correlación (r2) superior a 0,99. El límite de cuantificación (loq) es de 50 µg/l, y los valores de precisión relativa estándar (rsd%) en condiciones intermedias en todo el rango de medida oscilan entre el 3 y el 10%. Las recuperaciones obtenidas para diferentes concentraciones de ova purificada se encuentran en el rango del 90-110% en todos los casos. Además, se realizaron comparaciones con métodos elisa disponibles comercialmente utilizando diferentes tipos de vino, obteniendo una buena correlación entre ambos métodos. El método ovoalbúmina biosystems se ha validado para vinos y otras bebidas y es una herramienta útil para la determinación automatizada, rápida, precisa y sencilla de ova.

Altri generi. validazione di un nuovo metodo automatizzato per la quantificazione dell’ovoalbumina nel vino

l’ovoalbumina (ova), una proteina clarificante naturale, è particolarmente adatta alla chiarificazione dei vini rossi. aiuta a migliorare la stabilità tannica e polifenolica del vino, eliminando i tannini più astringenti e contribuendo ad ammorbidire e affinare la struttura. l’ova si lega alle particelle sospese, alle proteine, ai polisaccaridi e, in misura minore, ai tannini attraverso interazioni elettrostatiche e idrofobiche, formando complessi grandi che possono essere eliminati meccanicamente dal vino mediante chiarificazione e/o filtrazione prima dell’imbottigliamento. tuttavia, le allergie alimentari all’ova sono comuni e possono causare sintomi che vanno da lievi, come eruzioni cutanee, a gravi, come difficoltà respiratorie e reazioni anafilattiche nei casi più gravi. a livello internazionale, sono state adottate significative misure di sicurezza alimentare, come il regolamento (UE) n. 1169/2011 dell’unione europea, nonché il food allergen labeling and consumer protection act (falcpa) della fda e le normative del food standards australia new zealand (fsanz), tra le altre normative nazionali. queste normative disciplinano la dichiarazione di sostanze allergeniche sull’etichetta dei prodotti e stabiliscono linee guida per l’identificazione e l’etichettatura degli ingredienti, compresi gli agenti di chiarificazione proteici. nel caso specifico dei vini, il regolamento di esecuzione dell’UE n. 579/2012 impone l’etichettatura speciale per quei vini trattati con additivi allergenici. inoltre, la risoluzione OIV-secsan 709-2022 stabilisce criteri per la quantificazione dei residui allergenici nei vini, con un limite di quantificazione di 500 µg/l per l’ova. esistono diversi metodi di analisi per determinare la presenza di ovoalbumina nel vino, con il metodo elisa che è il più utilizzato per la quantificazione. in alternativa, ci sono test immunocromatografici rapidi o spettrometria di massa. questi metodi possono presentare sfide in termini di costo, complessità operativa e/o automazione. biosystems presenta un nuovo metodo per la quantificazione automatizzata dell’ova nel vino, basato su un test immunoturbidimetrico negli analizzatori di biosystems. è stato sviluppato un reagente in cui un anticorpo policlonale specifico per l’ova è stato immobilizzato sulla superficie di nanoparticelle di polistirene. le interazioni anticorpo-ova formano una rete che guida il processo di agglutinazione. il grado di agglutinazione provoca un aumento della torbidità che può essere misurato mediante spettrofotometria e è proporzionale alla quantità di ova presente nel campione e quantificabile tramite interpolazione di questi valori in una curva di calibrazione generata dai calibratori di concentrazione nota. il metodo include una soluzione di estrazione che facilita l’estrazione rapida e la stabilizzazione dell’ovoalbumina dal vino in un solo passaggio, il tutto a temperatura ambiente e in soli 15 minuti, in modo semplice ed efficiente. inoltre, viene fornita una soluzione concentrata di ova (spike solution) che consente di effettuare controlli interni e studi di recupero. i risultati della validazione condotta sul biosystems y15 analyzer mostrano che il metodo ha un range lineare da 50 a 1000 µg/l, con un coefficiente di correlazione (r2) superiore a 0,99. il limite di quantificazione (loq) è di 50 µg/l, e i valori di precisione relativa standard (rsd%) in condizioni intermedie su tutto il range di misura variano tra il 3 e il 10%. i recuperi ottenuti per diverse concentrazioni di ovoalbumina purificata si trovano nel range del 90-110% in tutti i casi. inoltre, sono state effettuate comparazioni con metodi elisa disponibili commercialmente utilizzando diversi tipi di vino, ottenendo una buona correlazione tra i due metodi. il metodo ovoalbumina biosystems è stato validato per vini e altre bevande ed è uno strumento utile per la determinazione automatizzata, rapida, precisa e semplice dell’ova.