Digital PCR: a tool for the early detection of brettanomyces in wine

Abstract

Brettanomyces bruxellensis is found in various ecological niches, but particularly in fermentative processes: beer, kombucha, cider and wine. In the oenological sector, this yeast is undesirable, as it can produce ethyl phenols, thus altering wine quality. These compounds are characterized by stable or horse-sweat aromas, unpleasant for consumers. Winemakers monitor the development of these microorganisms, as well as the production of these aromas. To support them, new tools from medical research are being developed, notably based on pcr (polymerase chain reaction).  It all began with end-point pcr: it enables exponential multiplication of the target dna using an enzyme, taq polymerase. This first generation of pcr consists in multiplying a target dna, giving a qualitative result. This was used for b. Bruxellensis, but the result did not provide any precision on the population level and therefore the inherent risk.  Subsequently, quantitative pcr was developed. Multiplication of the target dna is monitored by fluorescence. The number of multiplications required to reach a threshold fluorescence corresponds to the concentration of cells in the sample. This method can be used to quantify many microorganisms, including b. Bruxellensis, in wines. These results can be used to identify larger or smaller populations, enabling risk assessment.  Recently, however, digital pcr (dpcr) emerged, combining the advantages of end-point pcr and quantitative pcr. This tool originated in the healthcare sector, where it was used extensively during the health crisis to quantify the presence of sars-cov-2 virus. Dpcr is based on microfluidics and enables the sample to be dispersed into 30,000 reactions, where each strand of dna is isolated in a single reaction. Each reaction is an end-point pcr, which is either positive or negative, linked to fluorescence. Using statistical methods, the result obtained is an absolute value. The major advantage of this tool is the detection of rare elements, which is relevant to the early detection of b. Bruxellensis in wines. For the purpose of adapting the tool to the wine industry, our analytical laboratory has been working on fine-tuning its use. Firstly, work was carried out to limit the amplification of dead dna by selecting primers with a sufficiently long sequence to reduce this risk. Furthermore, wine is a matrix rich in polyphenols, which can inhibit pcr reactions. Consequently, the development and validation of automated dna extraction systems as a complement to dpcr has made it possible to avoid these inhibitors. Finally, the major advantage of dpcr is that it eliminates the need for a calibration range, as the result is an absolute value. To complete the study of dpcr, its use was compared with other recent tools already in use in the industry for the detection of b. Bruxellensis. These include specific probe cytometry (fish) and quantitative pcr. In this comparison, dpcr offers several advantages, such as being a rapid and reliable method for very low population levels, which other methods fail to achieve (1 cell per 10 ml of wine). Dpcr is a major asset for our industry. It could also be used to detect b. Bruxellensis in other matrices (grape berries, during hygiene checks in wineries or in the soils of high-risk plots). In addition, dpcr could be used to quantify b. Bruxellensis sub-groups determined by their behavior towards SO2 (sensitive or resistant), and thus provide professionals with the information they need to adapt their practices to deal with this spoilage yeast.

La digitale PCR pour la détection précoce de brettanomyces dans le vin

Brettanomyces bruxellensis est retrouvée dans différentes niches écologiques mais particulièrement dans des processus fermentaires : la bière, le kombucha, le cidre ou encore le vin. Dans la filière œnologique, cette levure est non désirée car elle est susceptible de produire des éthyl phénols, altérant ainsi la qualité des vins. Ces composés se caractérisent par des arômes d’écurie ou encore de sueur de cheval, désagréable pour les consommateurs. Les professionnels surveillent le développement de ces microorganismes tout comme la production de ces arômes. Pour les accompagner, de nouveaux outils issus de la recherche médicale se développent, notamment basés sur la pcr (polymerase chain reaction).  Tout a commencé avec la pcr en point final : elle permet une multiplication exponentielle de l’adn cible à l’aide d’une enzyme, la taq polymérase. Cette première génération de pcr consiste à multiplier un adn cible, donnant un résultat qualitatif. Ceci a été utilisé pour b. Bruxellensis mais le résultat n’apportait pas de précision sur le niveau de population et donc le risque inhérent.  Par la suite, la pcr quantitative s’est développée. La multiplication de l’adn cible est alors suivi par fluorescence. Le nombre de multiplications nécessaires pour atteindre une fluorescence seuil correspond alors à une concentration en cellules dans l’échantillon. Cette méthode permet de quantifier de nombreux microorganismes dont b. Bruxellensis dans les vins. Ces résultats permettent de mettre en évidence des populations plus ou moins importantes et d’évaluer ainsi les risques.  Mais depuis peu, la pcr digital (dpcr) à vue le jour, alliant les avantages de la pcr en point final et de la pcr quantitative. Cet outil est issu du milieu de la santé qui s’est beaucoup développer pendant la crise sanitaire pour quantifier la présence du virus sars-cov-2. La dpcr est basée sur la microfluidique, et permet de disperser l’échantillon en 30000 réactions, où chaque brin d’adn est isolé en une réaction. Chaque réaction est une pcr en point final qui va être positive ou négative liée à une fluorescence. Par des méthodes statistiques, le résultat obtenu est une valeur absolue. L’avantage majeur de cet outil et la détection d’éléments rares, qui est pertinent dans la détection précoce de b. Bruxellensis dans les vins. Dans le but de l’adapter à la filière vitivinicole, des mises au point de son utilisation ont été réalisées par notre laboratoire. Dans un premier temps, un travail a été effectué afin de limiter l’amplification des adn mort en sélectionnant des amorces visant une séquence suffisamment longue pour réduire ce risque. De plus, le vin est une matrice riche en polyphénols qui sont susceptibles d’inhiber les réactions pcr. Ainsi, la mise au point et la validation par des automates pour l’extraction d’adn en complément de dpcr ont permis de s’affranchir de ces inhibiteurs. Enfin, l’avantage majeur de la dpcr permet de se passer de gamme de calibration, car le résultat est une valeur absolue. Pour compléter l’étude de la dpcr, son utilisation a été comparée à d’autres outils récents déjà utilisés dans la filière pour la détection de b. Bruxellensis. C’est le cas de la cytométrie par sonde spécifique (fish) et la pcr quantitative. Dans ce comparatif, la dpcr présente plusieurs avantages comme être une méthode rapide et fiable pour des niveaux de populations très faibles, que les autres méthodes n’atteignent pas (1 cellule pour 10 ml de vin).  La dpcr est un atout majeur pour notre filière. Son utilisation pourrait être pertinente dans la détection de b. Bruxellensis pour d’autres matrices (baies de raisin, lors de contrôles d’hygiène dans les chais ou dans les sols des parcelles à risque). Egalement, la dpcr pourrait quantifier des sous-groupes de b. Bruxellensis déterminés par leur comportement vis-à-vis du so2 (sensibles ou résistantes) et ainsi apporter des éléments aux professionnelles pour qu’ils adaptent leurs pratiques face à cette levure d’altéra.

Digital PCR: una herramienta para la detección precoz de brettanomyces en el vino 

Brettanomyces bruxellensis se encuentra en diversos nichos ecológicos, pero sobre todo en procesos de fermentación como la cerveza, la kombucha, la sidra y el vino. En el sector enológico, esta levadura es indeseable debido a su probabilidad de producción de fenoles etílicos, alterando así la calidad de los vinos. Estos compuestos se caracterizan por aromas a establo o a sudor de caballo, desagradables para los consumidores. Los profesionales vigilan el desarrollo de estos microorganismos, así como la producción de estos aromas. Para ayudarles, se están desarrollando nuevas herramientas procedentes de la investigación médica, basadas en particular en la pcr (reacción en cadena de la polimerasa).  Todo empezó con la pcr de punto final, que permite multiplicar exponencialmente el adn diana utilizando una enzima, la taq polimerasa. Esta primera generación de pcr consiste en multiplicar un adn diana, dando un resultado cualitativo. Se utilizó para b. Bruxellensis, pero el resultado no proporcionaba ninguna precisión sobre el nivel de población y, por lo tanto, del riesgo inherente.  Posteriormente, se desarrolló la pcr cuantitativa. La multiplicación del adn diana se controla mediante fluorescencia. El número de multiplicaciones necesarias para alcanzar un umbral de fluorescencia corresponde a la concentración de células en la muestra. Este método puede utilizarse para cuantificar muchos microorganismos, incluido b. Bruxellensis, en los vinos. Estos resultados pueden utilizarse para identificar poblaciones de distintos tamaños y evaluar así los riesgos. Recientemente, sin embargo, surgió la pcr digital (dpcr), que combina las ventajas de la pcr de punto final y la pcr cuantitativa. Esta herramienta tiene su origen en el sector sanitario, donde se utilizó ampliamente durante la crisis sanitaria para cuantificar la presencia de covid-19. La dpcr se basa en tecnología de matríz microfluídica y permite dispersar la muestra en 30.000 reacciones, en las que cada cadena de adn se aísla en una única reacción. Cada reacción es una pcr de punto final que será positiva o negativa ligada a una fluorescencia. Utilizando métodos estadísticos, el resultado obtenido es un valor absoluto. La mayor ventaja de esta herramienta es la detección de elementos raros, lo que es relevante para la detección precoz de b. Bruxellensis en los vinos. Con el fin de adaptarlo a la industria vitivinícola, nuestro laboratorio de análisis ha estado trabajando en la puesta a punto de su uso. Inicialmente, se trabajó para limitar la amplificación de adn muerto seleccionando cebadores con una secuencia suficientemente larga para reducir este riesgo. Además, el vino es una matriz rica en polifenoles, que pueden inhibir las reacciones de pcr. Por ello, el desarrollo y la validación de sistemas automatizados de extracción de adn como complemento de la dpcr han permitido evitar estos inhibidores. Por último, la mayor ventaja de la dpcr es que no necesita un rango de calibración, ya que el resultado es un valor absoluto. Para completar el estudio de la dpcr, se comparó su uso con otras herramientas recientes ya utilizadas en la industria para detectar b. Bruxellensis. Entre ellas se encuentran la citometría con sonda específica y la pcr cuantitativa. En esta comparación, la dpcr presenta varias ventajas, como ser un método rápido y fiable para niveles de población muy bajos, que los otros métodos no alcanzan (1 célula por 10 ml de vino).  La dpcr es una baza importante para nuestra industria. También podría utilizarse para detectar b. Bruxellensis en otras matrices (bayas de uva, durante los controles de higiene en las bodegas o en el suelo de las parcelas de riesgo). La dpcr también podría servir para cuantificar subgrupos de b. Bruxellensis determinados por su comportamiento en relación con el so2 (sensibles o resistentes), proporcionando así a los profesionales la información que necesitan para adaptar sus prácticas para hacer frente a esta levadura de deterioro.