Mousy off-flavor detection: a rapid LCMS/MS method

Abstract

These days, consumers are interested in food products linked to the environment and the concept of naturalness. They prefer “free” products, such as those with no pesticide residues or no added sulfur dioxide (so2) in wines. In fact, so2 is the most widely used preservative in winemaking, as it has multiple properties at low cost: it is antioxidant, antioxidasic and antimicrobial. Reduced inputs and doses influence microbial communities during winemaking. This leads to microbial imbalances, and certain microorganisms are likely to impair wine quality. In connection with the reduction of so2 in winemaking practices, an organoleptic defect has emerged: mousy off-flavor. Today, scientific literature mentions 3 compounds responsible: 2-acetyl-1-pyrroline (2apy), 2-acetyltetrahydropyridine (athp) and 2-ethyltetrahydropyridine (ethp). These compounds are likely to be formed by various microorganisms such as lactic acid bacteria or brettanomyces bruxellensis from amino acids (lysine and ornithine).  This defect is characterized by descriptors such as “basmati rice”, “popcorn”, “sausage skin” or “mouse cage”, and is perceived mainly at oral ph.  To help professionals deal with this problem, laboratories offer a range of analytical methods for quantifying these compounds in wines. In 2019, an hplc-apci-ms/ms methodology was published for the analysis of athp in white wines, with limits of detection (lod) and quantification (loq) of 0.07 µg/l and 0.08 µg/l respectively. Whereas lod and loq in red wines were 0.21 µg/l and 0.23 µg/l. Finally, no hplc analysis was developed for all the compounds linked to this defect. Recently, in 2023, a methodology for the analysis of the 3 compounds with good recoveries by sbse-gc-ms was published. However, this method involves the basic ph of the matrix, affecting the equilibrium of the different forms of the heterocycles in question.  Because of these different analytical methods, our technical experts undertook extensive work to develop a new method for the determination of mouse tastes. This analytical method enables the quantification of the three compounds linked to mouse taste (athp, ethp and 2apy). The analysis does not require any modification of the starting matrix and is performed by hplc-ms/ms using two hydrophilic interaction chromatography columns capable of separating polar to highly polar compounds that would be poorly retained in traditional reversed-phase liquid chromatography separations. This methodology is both rapid (analysis time is 16 minutes) and sensitive: the lod and loq obtained are 0.4 µg/l and 1 µg/l respectively for 2apy and athp, and 1 µg/l and 3 µg/l for ethp in a white wine matrix.  This wonderful method has been developed to help practitioners characterize mouse taste by quantifying all the compounds responsible. Together with the d-lactic assay, the oenologist can also determine the microbial origin. Indeed, the production of d-lactic is a product of the consumption of sugars by bacterial communities, which appears to be correlated with the production of mouse taste molecules in the scientific literature. It may also be useful in other sectors, such as brewing, where mouse taste is an emerging problem.

Detección del sabor en ratones: un método rápido mediante LCMSMS

Hoy en día, los consumidores se interesan por productos alimentarios vinculados al medio ambiente y al concepto de naturalidad. Prefieren productos “libres”, como los que no contienen residuos de pesticidas o el dióxido de azufre (so2) añadido al vino. De hecho, el so2 es el conservante más utilizado en la elaboración del vino por sus múltiples propiedades y su bajo coste: es antioxidante, antioxidásico y antimicrobiano. La reducción de los aportes y de las dosis repercute en las comunidades microbianas durante la vinificación. Esto provoca desequilibrios microbianos, y es probable que algunos microorganismos afecten a la calidad del vino. La reducción del so2 en las prácticas de vinificación ha provocado la aparición de un defecto organoléptico: el gusto a ratón. Actualmente, la literatura científica menciona 3 compuestos responsables: 2-acetil-1-pirrolina (2apy), 2-acetiltetrahidropiridina (athp) y 2-etiltetrahidropiridina (ethp). Estos compuestos pueden ser formados por diversos microorganismos, como bacterias lácticas o brettanomyces bruxellensis, a partir de aminoácidos (lisina y ornitina).  Este defecto se caracteriza por descriptores como “arroz basmati”, “palomitas de maíz”, “piel de salchichón” o “jaula de ratón”, que se percibe principalmente en el ph bucal.  Para ayudar a los profesionales a hacer frente a este problema, los laboratorios ofrecen varios métodos analíticos para cuantificar estos compuestos en los vinos. En 2019, se publicó una metodología hplc-apci-ms/ms para el análisis de athp en vinos blancos, con límites de detección (lod) y cuantificación (loq) de 0,07 µg/l y 0,08 µg/l respectivamente. Los límites de detección (lod) y cuantificación (loq) en vinos tintos fueron de 0,21 µg/l y 0,23 µg/l. Pero no se desarrolló ningún análisis hplc para todos los compuestos relacionados con este defecto. Recientemente, en 2023, se publicó una metodología para analizar los 3 compuestos con buenas recuperaciones mediante sbse-gc-ms. Sin embargo, este método requiere que la matriz se ajuste a un ph básico, lo que afecta al equilibrio de las diferentes formas de los heterociclos en cuestión.  Basándose en estos diferentes métodos analíticos, nuestros expertos técnicos emprendieron un extenso trabajo para desarrollar un nuevo método de medición de los aromas de ratón. Este método analítico permite cuantificar los tres compuestos vinculados al gusto a ratón (athp, ethp y 2apy). El análisis no requiere ninguna modificación de la matriz de partida, y se lleva a cabo mediante hplc-ms/ms utilizando dos columnas de cromatografía de interacción hidrofílica capaces de separar compuestos polares a muy polares que serían poco retenidos en las separaciones tradicionales de cromatografía líquida en fase inversa. Este método es rápido (el tiempo de análisis es de 16 minutos) y sensible: el lod y el loq obtenidos son de 0,4 µg/l y 1 µg/l respectivamente para 2apy y athp y de 1 µg/l y 3 µg/l para ethp en una matriz de vino blanco.  Este método se desarrolló para ayudar a los profesionales a caracterizar el gusto a ratón cuantificando todos los compuestos responsables. Junto con el ensayo d-láctico, el enólogo también puede determinar el origen microbiano. En efecto, la producción de d-láctico es un producto del consumo de azúcares por las comunidades bacterianas, lo que aparece correlacionado con la producción de moléculas ligadas al defecto gusto a ratón en la literatura científica. También puede ser útil en otros sectores, como el cervecero, donde este defecto es un problema emergente.

De nos jours, les consommateurs s’intéressent à des produits alimentaires liés à l’environnement et au concept de naturalité. Ils privilégient les produits “sans”, comme sans résidus de pesticides ou sans ajout de dioxyde de soufre (so2) dans les vins. Effectivement, le so2 est le conservateur le plus utilisé au cours de l’élaboration d’un vin car il présente de multiples propriétés et un faible coût : il est antioxydant, antioxydasique et antimicrobien. La diminution des apports et des doses influence les communautés microbiennes au cours des vinifications. Ceci entraine ainsi des déséquilibres microbiens et certains microorganismes sont susceptibles d’altérer la qualité du vin. Corrélé à la diminution du so2 dans les pratiques vinicoles, un défaut organoleptique a émergé : le goût de souris. Aujourd’hui, la littérature scientifique fait mention de 3 composés responsables : 2-acetyl-1-pyrroline (2apy), 2-acetyltetrahydropyridine (athp) and 2-ethyltetrahydropyridine (ethp). Ces composés sont susceptibles d’être formés par différents microorganismes comme des bactéries lactiques ou encore brettanomyces bruxellensis à partir d’acides aminées (lysine et ornithine).  Ce défaut est caractérisé par des descripteurs comme « riz basmati », « popcorn », « peau de saucisson » ou encore « cage à souris » qui est perçu principalement au ph buccal.  Pour accompagner les professionnels dans cette problématique, les laboratoires proposent différentes méthodes analytiques pour quantifier ces composés dans les vins. En 2019 une méthodologie par hplc-apci-ms/ms été publié pour l’analyse de athp dans des vins blancs, avec des limites de détection (lod) et de quantification (loq) de 0,07 µg/l et 0,08 µg/l respectivement. Tandis que les lod et loq dans les vins rouges étaient de 0,21 µg/l et 0,23 µg/l. Finalement, aucune analyse par hplc n’a été développé pour l’ensemble des composés liés à ce défaut. Récemment, en 2023 une méthodologie pour l’analyse des 3 composés avec des bonnes récupérations par sbse-gc-ms était publié. En revanche, cette méthode implique la mise en ph basique de la matrice en affectant l’équilibre des différentes formes des héterocycles en question.  A partir de ces différentes méthodes analytiques, un long travail a été entrepris par nos experts techniques pour développer une nouvelle méthode de dosage des goûts de souris. Ainsi, cette méthode d’analyse permet la quantification des trois composés liés au goût de souris (athp, ethp et 2apy). L’analyse ne nécessite pas de modifier la matrice de départ, elle est faite par hplc-ms/ms en utilisant deux colonnes de chromatographie d’interaction hydrophile capables de séparer des composés polaires à hautement polaires qui seraient mal retenus dans les séparations traditionnelles par chromatographie liquide en phase inversée. Cette méthodologie est rapide (le temps d’analyse est de 16 minutes) et sensible : les lod et les loq obtenues sont de 0,4 µg/l et 1 µg/l respectivement pour 2apy et athp et de 1 µg/l et 3 µg/l pour le ethp dans une matrice vin blanc.  Cette méthode a été mise au point pour accompagner les praticiens dans la caractérisation du goût de souris par quantification de l’ensemble des composés responsables. Accompagné du dosage du d-lactique, l’œnologue pourra également déterminer l’origine microbienne. Effectivement, la production du d-lactique est un produit issu de la consommation des sucres par les communautés bactériennes, qui semble corrélé à la production des molécules de goût de souris dans la littérature scientifique. Elle peut également être utile dans d’autres filières comme la brasserie, où le goût de souris est une problématique émergeante.