Inactivated yeasts: a case study for the future of precision enology

Abstract

Yeasts serve as highly versatile tools in oenology. They do more than just perform alcoholic fermentation. Nowadays, yeasts from various species, naturally present in grapes, are selected for specific non-fermentative applications. For example, the use of selected non-saccharomyces at the early stage of winemaking has become a common practice to limit the growth of unwanted microorganisms. When inactivated, yeasts can be fractionated into soluble and insoluble fractions providing a wide range of benefits related to structural components or specific metabolites. Within the different yeast derivatives, saccharomyces inactivated yeasts (S-IY) are defined by the OIV as a biomass of saccharomyces spp. Inactivated (thermally or by ph change) and which may undergo the beginning of autolysis through endogenous enzymes. Finally, iy are mostly insoluble (60%) and are used as nutrient for fermentative yeast, rehydration enhancer or must / wine detoxifier. Recently, the capacity of iy to release intracellular antioxidant metabolites has gained interest for oenologists. Indeed, glutathione, a well-known antioxidant compound naturally produced by the yeast, can be accumulated by the yeast during biomass production and then released in the must by the inactivated yeast. These new oenological tools, called inactivated yeast with guaranteed glutathione level (gsh-iy), are used to improve the oxidative stability of the must and the wine by increasing the reduced glutathione content up to 20 mg/l at the early stage of winemaking. Besides the famous glutathione, many other components released by s-iy can be active in the must for antioxidant or nutritional purposes. Knowing the diversity within saccharomyces, it is therefore natural to investigate potential of iy from non-saccharomyces yeast (NS-IY) species naturally present in grapes.  In this presentation, we will show how the combination of high-resolution molecular analyses of s-iy and NS-IY, with physical chemistry and chemometrics support the actual and future development of better controlled enological processes.  Untargeted metabolomics applied to different gsh-iy soluble fractions clearly demonstrated that the accumulation of gsh in S-IY also promotes up to 2 times the accumulation of sulfur-containing compounds in selected s-iy strain. Interestingly, not only the antioxidant capacity is 3.3 times higher for gsh-iy compared to other s-iy, but it is not correlated to gsh released itself. It shed light on the activity of other antioxidant compounds released by s-iy, and notably sulfur-containing peptides over-released (46% of the global annotated peptides) by gsh-iy. When applied to ns-iy, the same approach unveiled the clear differences in metabolites released between different species. Among the studied non-saccharomyces species, one specific strain exhibited the same antioxidant capacity as gsh-iy while releasing very low amount of gsh (even compared to standard iy). The annotation of the metabolites correlated with the antioxidant capacity enables to hypothesize that different metabolic pathways are involved in non-saccharomyces and also reveals the potential for the future identification of new families of compounds with high antioxidant capacity. Finally, the combination of powerful analytical tools and rigorous strain selection and industrial process to inactivate and dry the inactivated yeasts enables the development of highly specialized inactivated yeasts for enology. In addition, the use of non-saccharomyces species could open a new avenue for the use of ns-iy related to their specific metabolism or cellular structure. This could lead to the development of novel oenological tools and techniques, paving the way for innovative solutions to future challenges in the field of oenology.

Levures inactivées : une étude de cas pour l’avenir de l’œnologie de précision

Les levures sont des outils extrêmement polyvalents en œnologie. Plus que simplement réaliser la fermentation alcoolique, elles peuvent être sélectionnées pour des applications non fermentaires spécifiques. Par exemple, l’ajout de non-saccharomyces sélectionnées au début de la vinification est devenue une pratique courante pour limiter la croissance des micro-organismes indésirables. Lorsqu’elles sont inactivées, les levures peuvent être décomposés en fraction solubles et insolubles offrant un éventail d’utilisation liés à leurs structures cellulaires ou à des métabolites spécifiques.  Parmi les différents dérivés de levure, les levures saccharomyces inactivées (S-IY) sont définies par l’OIV comme une biomasse de saccharomyces spp. Inactivée (thermiquement ou par changement de ph) et qui peut subir le début de l’autolyse par des enzymes endogènes. Les iy sont principalement insolubles (60%) et sont utilisées comme nutriment pour la levure fermentative, comme améliorateur de réhydratation de levures sèches actives ou comme détoxifiant pour le moût ou le vin.  Récemment, la capacité des s-iy à libérer des métabolites antioxydants intracellulaires a suscité l’intérêt des œnologues. En effet, le glutathion, un composé antioxydant naturellement produit par la levure, peut être accumulé pendant la production de biomasse puis libéré dans le moût par la levure inactivée. Ces nouveaux outils œnologiques, appelés levures inactivées à teneur garantie en glutathion (gsh-iy), sont utilisés pour améliorer la stabilité oxydative du moût et du vin en augmentant la concentration en glutathion réduit du mout jusqu’à 20 mg/l au début de la vinification.  Outre le célèbre glutathion, de nombreux autres composants libérés par les s-iy peuvent être actifs dans le moût à des fins antioxydantes ou nutritionnelles. Connaissant la diversité au sein des saccharomyces, il est donc naturel d’explorer sur le potentiel des levures inactivées non-saccharomyces (ns-iy) naturellement présentes sur les raisins.  Dans cette présentation, nous montrerons comment la combinaison d’analyses moléculaires de haute résolution de s-iy et de ns-iy, de la chimie physique couplé à la chimiométrie, soutient le développement actuel et futur de processus œnologiques mieux contrôlés.  La métabolomique non ciblée appliquée à des fractions solubles de gsh-iy a clairement démontré que l’accumulation de gsh dans les s-iy s’accompagne d’un doublement des composés azoto-soufré pour une souche spécifique de gsh-iy. Non seulement la capacité antioxydante est 3,3 fois plus élevée pour cette gsh-iy par rapport aux autres s-iy, mais elle n’est pas corrélée au gsh libéré lui-même. Cela met en lumière l’activité antioxydantes des autres composés libérés par les s-iy, et notamment des peptides contenant du soufre surabondamment libéré (46% des peptides globalement annotés) par cette gsh-iy. Lorsqu’elle est appliquée à NS-IY, l’approche métabolomique a révélé des différences de métabolites libérés entre les différentes espèces. Notamment, une souche spécifique a montré la même capacité antioxydante que les gsh-iy tout en libérant une très faible quantité de gsh. L’annotation des métabolites corrélés à la capacité antioxydante permet de supposer que différentes voies métaboliques sont impliquées chez les non-saccharomyces et révèle également le potentiel de nouvelles familles de composés à haute capacité antioxydante.  Finalement, la combinaison d’outils analytiques puissants et d’une maitrise de la sélection et de la production des souches permet le développement de levures inactivées hautement spécialisées pour l’œnologie. L’utilisation d’espèces non-saccharomyces pourrait ouvrir une nouvelle voie pour l’utilisation de ns-iy liées à leur métabolisme spécifique ou à leur structure cellulaire. Cela pourrait conduire au développement de nouveaux outils et techniques, ouvrant la voie à des solutions innovantes pour relever les défis futurs dans le domaine de l’œnologie.

Levaduras inactivadas: un estudio de caso para el futuro de la enología de precisión

Las levaduras sirven como herramientas versátiles en la enología. Hacen más que solo realizar la fermentación alcohólica. Hoy en día, se seleccionan levaduras de varias especies, naturalmente presentes en las uvas, para aplicaciones específicas no fermentativas. Por ejemplo, el uso de no-saccharomyces seleccionados en la etapa inicial de la vinificación es hoy una práctica común para limitar el crecimiento de microorganismos no deseados. Cuando se inactivan, las levaduras se pueden fraccionar en fracciones solubles e insolubles que proporcionan una amplia gama de beneficios ligados a componentes estructurales o metabolitos específicos.  Dentro de los diferentes derivados de levadura, las levaduras inactivadas de saccharomyces (S-IY) están definidas por la oiv como una biomasa inactivada (térmicamente o por cambio de ph) y que puede someterse a un inicio de autólisis a través de enzimas endógenas. Finalmente, las iy son mayoritariamente insolubles (60%) y se utilizan como nutrientes para la levadura fermentativa, mejorador de rehidratación o desintoxicante de mosto/vino.  Recientemente, la capacidad de las iy para liberar metabolitos antioxidantes intracelulares ha despertado interés para los enólogos. De hecho, el glutatión, un compuesto antioxidante bien conocido naturalmente producido por la levadura, puede ser acumulado por la levadura durante la producción de biomasa y luego liberado en el mosto por la levadura inactivada. Estas nuevas herramientas, llamadas levaduras inactivadas con nivel garantizado de glutatión (GSH-IY), se utilizan para mejorar la estabilidad oxidativa del vino aumentando el contenido de glutatión reducido hasta 20 mg/L en la etapa inicial de la vinificación.  Además del famoso glutatión, muchos otros componentes liberados por s-iy pueden ser activos en el mosto para fines antioxidantes o nutricionales. Conociendo la diversidad dentro de saccharomyces, es natural investigar el potencial de las iy de especies de levaduras no-saccharomyces (ns-iy) naturalmente presentes en las uvas.  En esta presentación, mostraremos cómo la combinación de análisis moleculares de alta resolución de s-iy y ns-iy, con química física y quimiometría, respaldan el desarrollo de procesos enológicos mejor controlados.  La metabolómica no dirigida aplicada a diferentes fracciones solubles de gsh-iy demostró claramente que la acumulación de gsh en s-iy también promueve hasta 2 veces la acumulación de compuestos que contienen azufre. Curiosamente, no solo la capacidad antioxidante es 3.3 veces mayor para gsh-iy en comparación con otros s-iy, sino que no está correlacionada con el gsh liberado. Esto arroja luz sobre la actividad de otros compuestos antioxidantes liberados por s-iy, y notablemente péptidos que contienen azufre sobre-liberados (46% de los péptidos anotados globalmente) por GSH-IY. El mismo enfoque reveló las claras diferencias en los metabolitos liberados por NS-IY entre las diferentes especies estudiadas, donde una cepa específica exhibió la misma capacidad antioxidante que GSH-IY mientras liberaba una cantidad muy baja de gsh (incluso en comparación con iy estándar). La anotación de los metabolitos correlacionados con la capacidad antioxidante permite hipotetizar que diferentes vías metabólicas están involucradas en no-saccharomyces y también revela el potencial para la futura identificación de nuevas familias de compuestos con alta capacidad antioxidante.  Finalmente, la combinación de herramientas analíticas poderosas y la rigurosa selección de cepas y procesos industriales para inactivar y secar las levaduras inactivadas permite el desarrollo de levaduras inactivadas altamente especializadas para la enología. Además, el uso de especies de no-saccharomyces podría abrir una nueva avenida para el uso de ns-iy debido a su metabolismo específico o estructura celular. Esto podría llevar al desarrollo de nuevas herramientas enológicas, abriendo el camino para soluciones innovadoras a los desafíos futuros de la enología.