Biotechnology in the system of improvement and propagation of complex-sustainable grape varieties in the South of Russia

Abstract

The production of certified grape planting material is one of the most important problems in the russian federation. According to the scheme for the production of healthy grape planting material, before being introduced into in vitro culture, the source plants of each variety (moldova, augustin, bart) were individually assessed for typical varietal characteristics and the presence/absence of symptoms of infection by pests. Grape plants with external symptoms of a viral infection were selected: sectoral reddening of the leaf blade, short nodes, downward curling of the leaf edge, corrugated leaf, change in color of the leaf blade. Carrying out phytosanitary monitoring based on external signs made it possible to exclude plants with visual manifestations of viral diseases. The next stage of analysis of the phytosanitary state of the source material consisted of testing the latent stage of the main viral diseases in asymptomatic plant samples intended for introduction into in vitro culture, selected at the first stage of the examination. In the process of preparing the source material, it was tested for the presence of the latent stage of viruses. Intensively growing green shoots of complex-resistant grape varieties augustin, moldova and bart, harvested from vegetating grape bushes, were used as the initial explant in in vitro culture. The original plant of the augustine variety showed a positive reaction to one of the five viruses studied – grapevine leafroll virus. Testing of regenerating plants of its clones (ag-56-06; ag-56-12-1; ag-56-23-3; ag-56-31-1) showed that out of 80 plants, only one (ag-56) -06) there was a positive reaction to the presence of the specified virus. Analysis of 80 plants of clones of the moldova variety (mo-126; mo-127; mo-128; mo-129) revealed a positive reaction in 1 plant (mo-126) to the yellow mosaic virus (grapevine yellow mosaic virus), as in the original donor plants (moldova varieties). The remaining regenerated plants (79 pcs.) Were absolutely healthy. The proportion of infected plants from the total number of analyzed plants was 1.25%. Plants that showed the absence of viruses based on testing results were assigned the category of “virus-free” basic clones. The assessment of regenerated grapevine varieties moldova, augustin and bart for the presence of quarantine phytoplasmoses for the territory of russia and the north caucasus: pathogens of golden yellowing of grapes (candidatus phytoplasma vitis flavescence doree, fd) and blackening of the bark (candidatus phytoplasma solani bois noir, bn) was carried out using pcr analysis. The analysis was carried out by real-time pcr (rt-pcr) using species-specific primers selected for the 16srrna gene region to identify the causative agents of grape phytoplasmosis fd and bn. Amplification of dna isolated from grape plants and target phytoplasmas was performed in pcr mode with electrophoretic detection of amplification results. Results of rt-pcr primers fdrtf/r and probe fd-fam with phytoplasma dna samples. After pcr was carried out on the tuf gene region, dna fragments of the desired size of 450 nucleotide pairs (bp) were detected. As a result of pcr analysis, it was established that the spectrum of fragments of the original genotypes of the varieties moldova and augustin contained dna fragments of 450 bp in size corresponding to candidatus phytoplasma vitis flavescence doree. The presence of pathogens was not detected in the bart variety. Analysis of the spectrum of fragments of regenerated grape plants obtained from apical meristems of the augustin variety showed the absence of a fragment of the pathogen candidatus phytoplasma vitis flavescence doree. Thus, regenerated grape plants obtained from apical meristems, unlike the original varieties moldova and augustin, no longer had fragments in their spectrum corresponding to the pathogen candidatus phytoplasma vitis flavescence doree, which confirms the release of the original plant from the pathogen.

La biotechnologie dans le système d’amélioration et de propagation de cépages complexes et durables dans le sud de la Russie

La production de matériel végétal certifié est l’un des problèmes les plus importants de la fédération de russie. Selon le schéma de production de matériel végétal sain, avant d’être introduites dans la culture in vitro, les plantes sources de chaque variété (moldavie, augustin, bart) ont été évaluées individuellement pour leurs caractéristiques variétales typiques et la présence/absence de symptômes d’infection. Par les nuisibles. Des plants de raisin présentant des symptômes externes d’infection virale ont été sélectionnés : rougeur sectorielle du limbe, nœuds courts, enroulement vers le bas du bord de la feuille, feuille ondulée, changement de couleur du limbe. La réalisation d’un suivi phytosanitaire basé sur des signes extérieurs a permis d’exclure les plantes présentant des manifestations visuelles de maladies virales. L’étape suivante de l’analyse de l’état phytosanitaire du matériel source a consisté à tester le stade latent des principales maladies virales sur des échantillons de plantes asymptomatiques destinés à être introduits en culture in vitro, sélectionnés lors de la première étape de l’examen. Au cours du processus de préparation du matériel source, celui-ci a été testé pour détecter la présence du stade latent des virus. Des pousses vertes à croissance intensive de cépages à résistance complexe augustin, moldavie et bart, récoltées sur des raisins en végétation, ont été utilisées comme explant initial dans une culture in vitro. La plante originale de la variété augustine a montré une réaction positive à l’un des cinq virus étudiés – le grapevine leafroll virus. Des tests sur des plantes régénératrices de ses clones (ag-56-06 ; ag-56-12-1 ; ag-56-23-3 ; ag-56-31-1) ont montré que sur 80 plantes, une seule (ag- 56) -06) il y a eu une réaction positive à la présence du virus spécifié. L’analyse de 80 plantes de clones de la variété moldavie (mo-126 ; mo-127 ; mo-128 ; mo-129) a révélé une réaction positive chez 1 plante (mo-126) au virus de la mosaïque jaune (grapevine yellow mosaïque virus) , comme dans les plantes donneuses originales (variétés moldavies). Les plantes régénérées restantes (79 pcs.) Etaient absolument saines. La proportion de plantes infectées par rapport au nombre total de plantes analysées était de 1,25 %. Les plantes qui présentaient l’absence de virus sur la base des résultats des tests ont été classées dans la catégorie des clones de base « exempts de virus ». L’évaluation des variétés de vigne régénérées moldavie, augustin et bart pour la présence de phytoplasmoses de quarantaine pour le territoire de la russie et du caucase du nord : agents pathogènes du jaunissement doré des raisins (candidatus phytoplasma vitis flavescence doree, fd) et du noircissement de l’écorce (candidatus phytoplasma solani bois noir, bn) a été réalisée par analyse pcr. L’analyse a été réalisée par pcr en temps réel (rt-pcr) à l’aide d’amorces spécifiques à l’espèce sélectionnées pour la région du gène 16srrna afin d’identifier les agents responsables de la phytoplasmose du raisin fd et bn. L’amplification de l’adn isolé des plants de raisin et des phytoplasmes cibles a été réalisée en mode pcr avec détection électrophorétique des résultats d’amplification. Résultats des amorces rt-pcr fdrtf/r et de la sonde fd-fam avec des échantillons d’adn de phytoplasme. Après que la pcr ait été réalisée sur la région du gène tuf, des fragments d’adn de la taille souhaitée de 450 paires de nucléotides (pb) ont été détectés. A la suite de l’analyse pcr, il a été établi que le spectre des fragments des génotypes originaux des variétés moldavie et augustin contenait des fragments d’adn d’une taille de 450 pb correspondant à candidatus phytoplasma vitis flavescence doree. La présence d’agents pathogènes n’a pas été détectée dans la variété bart. L’analyse du spectre de fragments de plants de raisin régénérés obtenus à partir des méristèmes apicaux du cépage augustin a montré l’absence d’un fragment du pathogène.

биотехнология в системе оздоровления и размножения комплексно-устойчивых сортов виноградана юге россии

Производство сертифицированного посадочного материала винограда является одной изважнейших проблем в российской федерации. Согласно схеме производства оздоровленногопосадочного материала винограда, перед введением в культуру in vitro исходные растения каждогосорта (молдова, августин, барт) индивидуально оценивали на типичные сортовые признаки иналичие/отсутствие симптомов заражения вредными организмами.  Были отобраны растениявинограда с внешними симптомами вирусной инфекции: секторальное покраснение листовойпластинки, короткоузлие, скручивание края листа книзу, гофрированный лист, изменение окраскилистовой пластинки. Проведение фитосанитарного мониторинга по внешним признакам позволилоисключить растения с визуальным проявлением вирусных болезней. Следующий этап анализафитосанитарного состояния исходного материала заключался в тестировании латентной стадииосновных вирусных болезней в бессимптомных образцах растений, предполагаемых для введения вкультуру in vitro, отобранных на первом этапе обследования. В процессе подготовки исходногоматериала проводилось его тестирование на наличие латентной стадии вирусов. В качествеисходного экспланта в культуре in vitro использовались интенсивно растущие зеленые побегикомплексно-устойчивых сортов винограда августин, молдова и барт, заготовленные свегетирующих кустов винограда. У исходного растения сорта августин была отмеченаположительная реакция на один из пяти исследуемых вирусов – вирус скручивания листьеввинограда (grapevine leafroll virus). Тестирование растений-регенерантов его клонов (аг-56-06; аг-56-12-1; аг-56-23-3; аг-56-31-1) показало, что из 80 растений только у одного (аг-56-06) отмечаласьположительная реакция на наличие указанного вируса. Анализ 80 растений клонов сорта молдова(мо-126; мо-127; мо-128; мо-129) выявил положительную реакцию у 1 растения (мо-126) на вирусжелтой мозаики (grapevine yellow mosaic virus), как и у исходного донорного растения (сортамолдова). Остальные растения-регенеранты (79 шт.) Были абсолютно здоровыми. Доляинфицированных растений от общего числа проанализированных растений составила 1,25%. Растениям, показавшим по результатам тестирования отсутствие вирусов, присваивали категорию«безвирусных» базисных клонов.  Оценку растений–регенерантов винограда сортов молдова, августин и барт на наличие карантинных для территории россии и северного кавказа фитоплазмозов: возбудителей золотистого пожелтения винограда (candidatus phytoplasma vitis flavescence doree, fd) и почернения коры (candidatus phytoplasma solani bois noir, bn) проводили с помощью пцр-анализа. Анализ осуществляли методом пцр «в реальном времени» (пцр-рв) с помощью видоспецифичных праймеров, подобранных на участок 16srrna гена для идентификации возбудителей фитоплазмозов винограда fd и bn. Амплификацию выделенной из растений винограда днк и целевых фитоплазм выполняли в режиме пцр с электрофоретической детекцией результатов амплификации. Результаты пцр-рв праймеров fdrtf/r и зонда fd-fam c образцами днк фитоплазм. После проведения пцр на участок tuf гена детектировали фрагменты днк искомого размера в 450 пар нуклеотидов (п.н.)  В результате пцр анализа установлено, что в спектре фрагментов исходных генотипов сортов молдова и августин присутствовали фрагменты днк размером 450 п.н., соответствующие candidatus phytoplasma vitis flavescence doree. У сорта барт наличие патогенна не выявлено. Анализ спектра фрагментов растений-регенерантов винограда, полученных из апикальных меристем сорта августин показал отсутствие фрагмента патогена candidatus phytoplasma vitis flavescence doree.  Таким образом, растения-регенеранты винограда, полученные из апикальных меристем, в отличие от исходных сортов молдова и августин, в своем спектре уже не имели фрагментов, соответствующих патогену candidatus phytoplasma vitis flavescence doree, что подтверждает освобождение исходного растения от патогена.